Laboratorijski Rezultati: Verižna Reakcija S Polimerazo (PCR)

Kazalo:

Laboratorijski Rezultati: Verižna Reakcija S Polimerazo (PCR)
Laboratorijski Rezultati: Verižna Reakcija S Polimerazo (PCR)

Video: Laboratorijski Rezultati: Verižna Reakcija S Polimerazo (PCR)

Video: Laboratorijski Rezultati: Verižna Reakcija S Polimerazo (PCR)
Video: Полимеразная цепная реакция 2024, Marec
Anonim

Laboratorijski rezultati: verižna reakcija s polimerazo (PCR)

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je najpomembnejša laboratorijska metoda za preučevanje fine molekularne strukture genskega materiala. Ta je sestavljena iz deoksiribonukleinske kisline (DNA), ki gradi genetsko kodo ljudi, pa tudi živali in rastlin.

V humani medicini se PCR uporablja za razjasnitev dednih bolezni in genetskih vprašanj (nevarnost bolezni, test očetovstva itd.), Pa tudi pri diagnozi številnih nalezljivih bolezni. V nasprotju s serološko diagnostiko (določanje protiteles proti patogenom v krvi) metode PCR predstavljajo neposredno laboratorijsko medicinsko metodo odkrivanja za razjasnitev nalezljivih bolezni.

Po eni strani je prednost PCR hitra razpoložljivost rezultatov testa. Poleg tega so metode PCR običajno zelo občutljive.

navigacija

  • nadaljujte z branjem
  • več o tej temi
  • Nasveti, prenosi in orodja
  • Kaj je verižna reakcija s polimerazo (PCR) in kaj se preiskuje?
  • Kako deluje PCR?
  • Kakšne rezultate testa zagotavlja PCR?
  • Ali obstajajo nadaljnji dosežki pri običajni PCR?
  • Katera so glavna področja uporabe PCR?
  • Ali obstajajo referenčne vrednosti za rezultate testov PCR?

To pomeni, da tudi najmanjše količine genskega materiala patogena (bakterije, virusi itd.) Vodijo do zanesljivo pozitivnega rezultata v obdobju odkrivanja zadevnega patogena v ustreznem preskusnem materialu. Kot material za preiskave metod PCR se uporabljajo predvsem kri, pa tudi druge telesne tekočine (sputum, urin, tekočina itd.).

Kaj je verižna reakcija s polimerazo (PCR) in kaj se preiskuje?

Verižna reakcija s polimerazo ("verižna reakcija s polimerazo" - PCR) je najpomembnejša laboratorijska metoda za preučevanje fine molekularne strukture genskega materiala. Iz tega razloga se ta metoda preiskave imenuje tudi tako imenovana

“Molekularna diagnostika”

Osnova genskega materiala (imenovanega tudi "genski material") je posebna molekula z dolgo verigo:

"DNA" (deoksiribonukleinska kislina)

Pri ljudeh se genski material, sestavljen iz dvoverižne DNA (dve komplementarni verigi) nahaja v jedru vseh telesnih celic, pri čemer imajo vse telesne celice posameznika enak genski material. Poleg tega je natančna sestava genetske sestave vsakega posameznika edinstvena - primerljiva s prstnim odtisom, ki je prav tako edinstven za vsakega človeka.

Iz tega razloga se imenuje tudi genski material

"Genetska koda" pomeni, ker je načrt vseh telesnih struktur osebe preslikan v tej šifrirani obliki in je na ta način shranjen in ga je mogoče posredovati naprej

V celičnih jedrih telesnih celic je DNK v posebnem vrstnem redu, znanem kot

Kromosomi (dedna telesa) se imenujejo. Pri ljudeh se te v telesnih celicah vedno pojavijo v parih, ena se podeduje po materi, druga pa po očetu. V tem smislu vse telesne celice osebe vsebujejo skupaj 46 kromosomov - 22 parov tako imenovanih avtosomov in en par tako imenovanih spolnih kromosomov

S pomočjo laboratorijske metode PCR lahko na eni strani preučimo fino strukturo človeške DNK, kar je pomembno za diagnosticiranje bolezni ali razjasnitev določenih vprašanj:

  • Razjasnitev dednih bolezni,
  • Ocena tveganja bolezni,
  • Raziskovanje prirojenih posebnosti presnove,
  • forenzična (tako imenovana "forenzična") analiza (npr. dokaz o očetovstvu) in še veliko več

Po drugi strani pa ljudje nimajo samo ustrezne genetske sestave, ampak dejansko imajo vse življenjske oblike na Zemlji poseben genetski sestavek:

  • Živali,
  • Rastline,
  • Gobe,
  • Bakterije,
  • Virusi,
  • Paraziti itd.

Genetska sestava teh oblik življenja je v glavnem sestavljena tudi iz DNA ali, v primeru nekaterih virusov, tudi iz RNA (ribonukleinske kisline), ki je v nasprotju z DNA enoverižna. V medicinski diagnostiki se PCR zato uporablja tudi za razjasnitev številnih nalezljivih bolezni:

  • bakterijske okužbe (npr. tuberkuloza, bakterijske spolno prenosljive bolezni),
  • virusne okužbe (npr. virusni hepatitis, okužba s HIV),
  • parazitske okužbe (npr. malarija) in še veliko več

Kako deluje PCR?

Metodo PCR je leta 1983 razvil ameriški biokemik Kary B. Mullis in v osnovi temelji na dveh načelih:

  • Množenje ("pomnoževanje") tudi majhnega dela genskega materiala (DNA ali RNA)
  • Odkrivanje in identifikacija pomnoženih ("ojačanih") produktov ojačanja.

Za PCR so zato potrebne naslednje komponente:

  • preskusni material (npr. vzorci krvi, celic ali tkiva),
  • nekateri reagenti ("polimeraza", "primer", "nukleotidi" (to so gradniki DNA) itd.) in laboratorijska oprema za ojačanje genskega materiala
  • sistem za zaznavanje izdelkov PCR.

V smislu reagentov in laboratorijske opreme, potrebne za izvajanje PCR, je naslednji encim v središču celotnega procesa PCR:

polimeraza Taq

To je encim, ki ga dobimo iz mikroorganizma "Thermus aquarius" (Taq) - bakterijskega seva, ki obstaja v bližini vročih vulkanskih izvirov in lahko preživi, prilagojen visokim temperaturam svojega okolja.

Posebnost Taq polimeraze je, da lahko ta encim svojo funkcijo izpolnjuje tudi pri visokih temperaturah nad 50 ° C (C) - in sicer

množenje ("pomnoževanje") DNA

Poleg polimeraze Taq je treba pred analizo PCR natančno določiti, kateri del DNK je treba pregledati. V ta namen potrebujete kratke fragmente DNA, katerih fina struktura ustreza ciljni regiji DNA glede na ustrezno genetsko kodo (»zaporedje DNA). Ti fragmenti DNA se imenujejo

"Primer" imenovan

Dejanski postopek pomnoževanja v okviru PCR končno obsega naslednje korake:

  • Ekstrakcija genskega materiala (DNA ali RNA) iz preskusnega materiala.

    Pri analizi RNA je treba kodno zaporedje ribonukleinske kisline najprej pretvoriti v kodno zaporedje DNA, kar je treba opraviti z encimom "reverzna transkriptaza" v analitičnem koraku pred dejanskim pomnoževanjem

  • Ojačitev genskega materiala v več korakih ("ciklih"):

    • Prvi korak - "denaturacija DNA": s segrevanjem (95 ° C) dvoverižne DNA se stopi v enojne verige.
    • Drugi korak - "Žarjenje": pri nižji temperaturi (približno 55 ° C) se lahko "primerji" pritrdijo na svoja ciljna zaporedja DNA.
    • Tretji korak - "raztezek": pri temperaturi 72 ° C encim Taq polimeraza zdaj razširi ("podaljša") začetno zaporedje primerja z uporabo tako imenovanih "nukleotidov" (to so gradniki DNA) in ga gradi na ta način nova, podolgovata molekula DNA.

Ker se koraki od enega do dveh ponavljajo v več ciklih, nastajajo daljše in daljše novonastale verige DNA, od koder izvira tudi ime tega laboratorijskega procesa "verižna reakcija s polimerazo".

  • Analiza novonastalih verig DNA (tako imenovani "izdelki PCR"):

    Na koncu verižne reakcije (ciklov) se produkti PCR - torej novonastale molekule DNA - preučijo in ovrednotijo kvalitativno ali kvantitativno. Obstaja veliko možnosti za samo to oceno, ki večinoma temelji na obarvanju (zlasti fluorescentnih barvil) DNA in njeni vidnosti (z gelsko elektroforezo ali fotometrično zaznavo fluorescence)

Kakšne rezultate testa zagotavlja PCR?

Rezultate sodobnih metod PCR lahko povzamemo v dve skupini:

  • kakovostne in
  • kvantitativni rezultati.

Pri kvalitativni PCR se preuči, ali je v preskusnem materialu prisoten določen del genskega materiala (DNA ali RNA) („pozitiven“rezultat) ali ne („negativni“rezultat).

Kvalitativni PCR se zato v glavnem uporablja za razjasnitev naslednjih diagnostičnih vprašanj (rezultati "da / ne"):

  • Diagnoza dednih bolezni,
  • Razjasnitev mutacij,
  • Priznavanje genetskih značilnosti (npr. Nagnjenost k nekaterim boleznim) itd.

Kvantitativna PCR je nadaljnji razvoj te laboratorijske metode, pri kateri se ne zazna samo prisotnost določenega območja genskega materiala, temveč tudi količina genskega materiala hkrati. V skladu s tem se kvantitativni PCR uporablja predvsem na naslednjih področjih medicine:

  • Kot del diagnoze okužbe je mogoče natančno določiti količino patogenov v pacientovem telesu. V primeru virusnih okužb se ta metoda PCR uporablja za zdravljenje t.i.

    Preučena virusna obremenitev

Poleg tega je kvantitativna PCR zelo pomembna tudi pri temeljnih raziskavah, pri čemer ima ta proces koristi ne samo humana medicina, temveč tudi številna druga znanstvena področja (veterina, biokemija, biologija itd.)

Prednost PCR pri diagnozi nalezljivih bolezni je, da so rezultati testov te laboratorijske metode na voljo izjemno hitro (običajno v enem delovnem dnevu). Poleg tega je PCR zelo občutljiva laboratorijska metoda. To pomeni, da tudi najmanjše količine bakterij ali virusov v preskusnem materialu vodijo do zanesljivo pozitivnega rezultata.

Ali obstajajo nadaljnji dosežki pri običajni PCR?

Poseben nadaljnji razvoj metodologije PCR je

Multiplex PCR

Pri multipleksni PCR se hkrati uporablja več ciljnih zaporedij DNA (beri: več začetnic). Tako nastane mešanica izdelkov PCR, ki jih je treba zaznati in ustrezno ovrednotiti.

Multiplex PCR se v glavnem uporablja tudi v medicini

  • tudi človeška genetika
  • diagnozo okužbe.

Prednost te metode je, da je treba od pacientov pridobiti manj materiala za preskušanje in v enem koraku analize ustvariti vrsto rezultatov testa. Vendar te prednosti v zvezi z diagnostiko v mnogih primerih nadomešča visoka cena analize.

Druga posebnost uporabe PCR je laboratorijski postopek

Sekvenciranje DNA

To je diagnostična možnost za razvozljanje natančnega zaporedja genetske kode pri bolniku. Metoda zaporedja lahko temelji tudi na tehnologiji PCR.

Ker pa je sekvenciranje precej bolj zapleteno in drago kot običajne metode PCR, je trenutno rezervirano za posebne diagnostike (razširjene analize genomov) in znanstvena vprašanja.

Katera so glavna področja uporabe PCR?

Kar zadeva področja uporabe PCR v humani medicini, se ta laboratorijski postopek uporablja za naslednja diagnostična vprašanja:

  • Pojasnitev dednih bolezni - že obstajajo metode PCR za več kot 600 različnih dednih bolezni.
  • Farmakogenetika - s preučevanjem genetskih značilnosti jetrne presnove lahko sklepamo o učinkovitosti in odmerjanju zdravil.
  • Tumorska medicina ("onkologija") - tu se po eni strani PCR uporablja za razjasnitev dejavnikov tveganja za nekatere tumorske bolezni (npr. Rak dojke). Po drugi strani pa lahko celice in tkiva v tumorjih, ki so se že pojavili, preučimo tudi glede različnih mutacij, ki imajo vedno bolj pomembno vlogo pri zdravljenju zlasti teh bolezni.
  • Sodna medicina ("forenzika") - tu je PCR zelo pomembna na primer v postopkih očetovstva in v kriminologiji ("odvzem DNK prstov").
  • Zdravilo za okužbe - PCR ima nepogrešljivo vrednost pri diagnozi, napredovanju in nadzoru terapije bakterijskih, virusnih in parazitskih nalezljivih bolezni.

Za več informacij o raku glejte Rak.

Ali obstajajo referenčne vrednosti za rezultate testov PCR?

Glede referenčnih vrednosti v metodah PCR je treba vedno upoštevati ustrezno diagnostično vprašanje. Ker se med pregledom za dedne bolezni (npr. Analiza mutacij) odkrijejo nekatere genetske značilnosti, v takih laboratorijskih analizah ni referenčne vrednosti ("pozitivne" ali "negativne"), tako kot na primer ni referenčne vrednosti za barvo las. Ker je tudi barva las genetska značilnost.

Poleg tega veljajo za laboratorijske analize prirojenih dednih lastnosti strogi predpisi v tej državi, za katere so odločilne določbe avstrijskega zakona o genskem inženiringu (GTG) (določitev obstoječe bolezni po 65. členu GTG). Posledično lahko to analizo opravi medicinski laboratorij le po pisni potrditvi osebe, ki jo je treba pregledati, starša ali zakonitega skrbnika (v primeru mladoletnikov, ki ne morejo sprejeti odločitve) ali zakonitega zastopnika (v primeru polnoletnih oseb, ki ne morejo sprejeti odločitve) o izčrpnih informacijah, ki jih lečečega zdravnika je treba opraviti glede tega genetskega testa (oddelek 69 GTG).

Poleg tega imajo bolniki na splošno pravico prepovedati izvajanje genetskih testov na sebi.

Za nečloveške genetske PCR laboratorijske analize pa veljajo manj strogi predpisi. Večinoma gre za laboratorijske metode s področja diagnoze okužbe.

Glede referenčnih vrednosti teh laboratorijskih metod je treba razlikovati med kvalitativnimi in kvantitativnimi metodami:

Kvalitativne metode PCR običajno dajo "pozitiven" ali "negativen" rezultat, pri čemer je "negativni" običajno referenčna vrednost

Pri kvantitativni PCR metodi so odvisno od metode določene ustrezne mejne vrednosti (tako imenovane „mejne vrednosti“), od katerih je treba rezultat oceniti kot patološki.

Priporočena: